革蘭氏陰性菌,如大腸桿菌（E. coli）和假單胞菌(Pseudomonads)等的細胞壁成分被認為是內毒素。它們具有一個(gè)親水性多糖和親脂性脂質(zhì)結構，有別于它們所源自的細菌,具有高度的熱穩定性和pH穩定性。內毒素屬于致熱源，如果它們與粘膜發(fā)生接觸或者一旦它們進(jìn)入血液循環(huán)，便會(huì )導致發(fā)熱（參考文獻詳見(jiàn)Steck, 20061）。
根據通用的藥典，在藥物的生產(chǎn)工藝中內毒素含量不可超出所規定的限值。
在生物制藥（如：免疫球蛋白）生產(chǎn)所需的哺乳動(dòng)物細胞培養中，內毒素的出現可能會(huì )導致死亡。因此，在生物制藥生產(chǎn)、細胞系傳代，或者細胞培養過(guò)程中需要使用超純培養基，當然也相應的需要超純水，它們所含有的內毒素含量水平已獲證明低于所規定的限值。
本研究的目的在于展示Arium pro VF系統產(chǎn)生的超純水所具有的內毒素含量遠遠低于規定的限值，因而可用于上述各種應用。
實(shí)驗方法
為了對Arium pro VF系統所生產(chǎn)的超純水中的內毒素含量進(jìn)行檢測，我們分別采用了凝膠法和顯色法來(lái)測試。
實(shí)驗結果
在0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的濃度范圍內，凝膠法顯示的是陰性結果，意即無(wú)凝膠形成（無(wú)內毒素檢測到；見(jiàn)表1）；當濃度≥0.1 EU/ml時(shí)發(fā)生了凝集反應。該結果顯示了在凝膠法的檢測敏感限值內，在A(yíng)rium pro VF系統所生產(chǎn)的超純水中未出現內毒素。
顯色法中，在405nm波長(cháng)處的60吸附讀數（見(jiàn)下圖）根據標準樣品中內毒素含量的不同生成了不同斜率的曲線(xiàn)。達到吸收率所需要的時(shí)間通過(guò)特殊的計算機程序進(jìn)行計算，并將之用為推斷具有未知內毒素含量的樣品的依據（具體的值詳見(jiàn)表1-顯色測試）。由于具有最di低濃度（0.005-0.001 EU/ml）的標準樣品和Arium水未達到所需的計算內毒素含量的消光值，因此它們被認定為低于檢測限值。
Arium pro VF超純水所獲得的值明顯比0.001 EU/ml曲線(xiàn)的繪制點(diǎn)更加低。下圖顯示了與兩個(gè)選定的內毒素標準（0.05 EU/ml and 0.005 EU/ml）相比，在自來(lái)水、去離子水（DI水）和Arium水中所測得的內毒素濃度的數據集合。在水樣品中的內毒素含量通過(guò)使用內毒素標準所測得的值來(lái)計算，詳見(jiàn)表2.
在DI水樣品中，檢測到內毒素為0.02 EU/ml，這個(gè)值低于WFI（注射用水）現行的有效值。在自來(lái)水中，出乎意料地檢測到高達25 EU/ml的內毒素載量。該結果未作進(jìn)一步分析。與之相對，在系統所產(chǎn)生的超純水中所檢測到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，這個(gè)值遠遠低于常見(jiàn)的限值。
在DI水樣品中，檢測到內毒素為0.02 EU/ml，這個(gè)值低于WFI（注射用水）現行的有效值。在自來(lái)水中，出乎意料地檢測到高達25 EU/ml的內毒素載量。該結果未作進(jìn)一步分析。與之相對，在系統所產(chǎn)生的超純水中所檢測到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，這個(gè)值遠遠低于常見(jiàn)的限值。
結論
測試結果顯示了Arium pro VF系統生產(chǎn)的超純水可作為一種方便、實(shí)惠的選擇，用于內毒素測試的樣品制備，因為在其所生產(chǎn)的超純水中檢測到的內毒素濃度非常低（<0.001 EU/ml）。得到的結果也證實(shí)了早期關(guān)于在A(yíng)rium超純水中發(fā)現內毒素載量<0.001 EU/ml的試驗。
在此超純水中的內毒素濃度遠遠低于美國藥典所規定的限值，這也使得該超純水理論上適用于制藥產(chǎn)品的生產(chǎn)/內毒素監測方面。相關(guān)的例子包括產(chǎn)品制劑，透析過(guò)濾解決方案，層析緩沖液以及用于萃取、清洗、無(wú)菌步驟和細胞培養方案的水等。
在細胞培養應用范圍內，我們需要在工藝的各個(gè)步驟都對污染物保持高度警惕。為了對內毒素對細胞培養物及細胞敏感度的影響保持可控，尤其是與此類(lèi)內毒素相關(guān)時(shí)，用于細胞培養的培養基都必須要明確不含可檢測到的內毒素含量（見(jiàn)參考文獻5）。
參考文獻/更多信息
1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006.
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009.
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany.
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007.
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012
